Comment concevoir des amorces pour la mutagenèse dirigée sur site

La mutagenèse dirigée (SDM) est une in vitro méthode de création d'une mutation dans une séquence connue. Il est souvent effectué par des méthodes basées sur la PCR. Typiquement, une ou deux bases sont modifiées dans la mutagenèse dirigée. Les amorces peuvent être conçues avec les mutations souhaitées pour introduire de petits changements dans la séquence nucléotidique. L'extension d'amorce et la PCR inverse peuvent être utilisées pour introduire des mutations à grande échelle. Cette approche peut modifier la composition en acides aminés d'une protéine particulière. La mutagenèse dirigée est utilisée pour étudier les modifications de l'activité des protéines. Il est également utilisé pour créer des protéines de fusion.

Zones clés couvertes

1. Qu'est-ce que la mutagenèse dirigée par site (SDM)?
      - Définition, rôle, méthode
2. Comment concevoir des amorces pour la mutagenèse dirigée sur site
     - Substitutions, Suppressions, Insertions

Termes clés: Suppressions, insertions, mutations, mutagenèse dirigée sur site, substitutions, PCR traditionnelle

Qu'est-ce que la mutagenèse dirigée par site?

La mutagenèse dirigée sur site est une technique de biologie moléculaire utilisée pour introduire des modifications spécifiques dans une séquence de nucléotides d'un gène. Il est utilisé pour modifier la séquence d'acides aminés d'une protéine, introduire ou supprimer des sites de restriction, détruire les sites de liaison de la transcription et créer des protéines de fusion..

Processus

Au cours de la mutagenèse dirigée, les mutations sont introduites dans les plasmides en utilisant des amorces, consistant en la mutation souhaitée. La matrice entière est amplifiée par PCR, incorporant la mutation dans la matrice. Ensuite, la matrice parent est retirée de l'échantillon à l'aide d'une enzyme, l'endonucléase dépendante de la méthylation. Le produit de PCR ou la molécule de plasmide à coupure portant la mutation souhaitée est transformée en bactérie. Les plasmides peuvent être isolés des bactéries avec les modifications souhaitées. Le processus de mutagenèse dirigée est présenté dans Figure 1.

Figure 1: Mutagenèse dirigée sur le site

Trois principaux types de méthodes sont utilisés pour introduire les mutations souhaitées dans la mutagenèse dirigée. Ce sont la PCR traditionnelle, l’extension d’amorce et la PCR inverse. L'extension d'amorce et la PCR inverse peuvent être utilisées pour introduire des modifications de nucléotides à grande échelle.

PCR traditionnelle

La PCR traditionnelle peut être utilisée pour introduire un ou deux changements de nucléotide dans la séquence cible avec des amorces modifiées. Les modifications peuvent être des substitutions, des délétions ou des additions de nucléotides. La mutation est incorporée dans l'amplicon lors de la PCR. Par conséquent, la séquence d'origine est remplacée par la séquence mutée dans l'amorce..

Primer Extension

Dans l'extension de l'amorce, la mutation souhaitée est incorporée lors d'une PCR nichée. Ici, la séquence cible est flanquée de deux amorces. La mutation souhaitée est incorporée à l'amorce interne et la mutation est introduite dans le deuxième tour PCR. En règle générale, la spécificité d'une réaction PCR diminue avec l'augmentation du nombre de nucléotides incompatibles dans les amorces. Cependant, de longues amorces internes avec des mutations à grande échelle peuvent être utilisées dans l'extension des amorces, car la PCR nichée peut augmenter la spécificité de la réaction de PCR..

PCR inverse

La PCR inverse est une méthode d’amplification de fragments d’ADN inconnus en concevant des amorces pour une séquence d’ADN connue. Il peut être utilisé pour substituer, supprimer ou insérer des nucléotides à grande échelle..

Les applications de la mutagenèse dirigée sont décrites ci-dessous..

1. Étudier la structure, la fonction et les propriétés catalytiques des protéines
2. Améliorer les propriétés des protéines (ingénierie des protéines)
3. Introduire ou supprimer des sites d'endonucléases de restriction.

Comment concevoir des amorces pour la mutagenèse dirigée sur site

La mutagenèse dirigée est un processus d'introduction de la mutation souhaitée au moyen d'une amorce. La mutation peut être une substitution, une insertion ou une suppression. Lorsque la spécificité de la PCR diminue avec l’augmentation du nombre de nucléotides incompatibles dans l’amorce, la PCR traditionnelle ne peut introduire que des modifications d’une ou deux paires de bases de la séquence cible. D'autres méthodes telles que l'extension d'amorce et la PCR inverse peuvent être utilisées pour introduire des mutations à grande échelle. La conception de l’amorce dans la mutagenèse dirigée est présentée dans Figure 2.

Figure 2: Amorces pour la mutagenèse dirigée sur le site

Substitution

Pour les substitutions, l'une des deux amorces devrait contenir la mutation souhaitée au milieu de l'amorce. Ici, le site contenant la mutation n’annule pas la séquence cible car il forme une distorsion..

Effacement

Pour les suppressions, la séquence à supprimer de la cible peut être négligée lors de la conception de l’amorce. Comme cette séquence est située en dehors de la région flanquée par des amorces, elle ne serait pas amplifiée pendant la PCR..

Insertion

Pour les insertions, la séquence à ajouter est emmêlée à l'extrémité 5 'de l'une des amorces lors de la conception de l'amorce. Par conséquent, la séquence insérée peut rester attachée à l’amplicon.

Conclusion

La mutagenèse dirigée sur site est une technique utilisée pour introduire des mutations dans une séquence d'ADN. Ces mutations peuvent être des substitutions, des insertions ou des délétions. Des mutations à petite échelle peuvent être introduites dans la PCR traditionnelle. Des mutations à grande échelle peuvent être introduites dans l'extension d'amorce ou la PCR inverse. L'introduction de la mutation se fait par incorporation de la mutation souhaitée à l'amorce. 

Référence:

1. «Méthodes de mutagenèse dirigée par site». TECHNOLOGIES ADN INTEGREES, Disponible ici.

Courtoisie d'image:

1. «Mutagenèse dirigée sur un site» de Knbusby - Travail personnel (domaine public) via Commons Wikimedia