Comment isoler l'ARNm de l'ARN total

Les combinaisons oligo-dT / support sont principalement utilisées dans la purification d'ARNm à partir d'ARN total par une technique connue sous le nom de chromatographie par affinité. Il existe deux méthodes principales pour isoler l'ARNm de l'ARN total en fonction du type de cellules; à savoir, méthode directe d'isolement de l'ARNm et méthode moins d'isolement de l'ARNm. Les deux méthodes sont expliquées dans cet article.

L'ARN messager (ARNm) est un produit de transcription composé d'une série de nucléotides d'ARN. Il transporte des informations dans les gènes du noyau au cytoplasme pour la synthèse de protéines. L'isolement de l'ARN à partir d'une lignée cellulaire particulière donne l'ARN total, qui consiste en ARNr et ARNt ainsi qu'en ARNm. Par conséquent, l'ARNm doit être séparé du mélange d'ARN total lors de l'étude du transcriptome de la lignée cellulaire. Des propriétés uniques de l'ARNm, telles que la présence d'une queue poly (A) à l'extrémité 3 'de la molécule d'ARNm, sont utilisées pour la séparation. Puisque les molécules d’oligo-dT sont complémentaires de la queue poly (A), l’ARNm peut être isolé d’un mélange d’ARN total.

Zones clés couvertes

1. Qu'est-ce que l'ARNm?
     - Définition, structure, fonction
2. Quelle est la composition de l'ARN total
    - ARNm, ARNr, ARNt
3. Comment isoler l'ARNm de l'ARN total
    - Utilisation de molécules oligo-dT / Carrier

Mots-clés: chromatographie d'affinité, ARN messager (ARNm), méthode Minus, Oligo dT, queue Poly (A), ARN total

Qu'est-ce que l'ARNm?

L'ARNm est un transcrit d'un gène codant pour une protéine. Il est produit à l'intérieur du noyau chez les eucaryotes et contient des informations pour la production d'une protéine particulière dans le cytoplasme. Il est traduit en séquence d'acides aminés de la protéine au cours de la traduction, assistée par des ribosomes. Le transcrit primaire produit par la transcription des eucaryotes est appelé le pré-ARNm.

Figure 1: Structure de l'ARNm

Au cours des modifications post-transcriptionnelles, une molécule d'ARNm mature est produite avec plusieurs caractéristiques telles que la coiffe en 5 'et la queue poly (A). L'ARNm total d'un organisme particulier est appelé son transcriptome.

Quelle est la composition de l'ARN total

Le résultat de l'isolement de l'ARN s'appelle l'ARN total. Il est composé des trois principaux types d'ARN produits par une cellule. Ils sont l'ARNm, l'ARNt et l'ARNr. L’ARNt et l’ARNr aident à la traduction. La taille de l'ARNm eucaryote est de 0,5 à 20 kb. L'ARN de transfert (ARNt) apporte les acides aminés correspondants lors de la traduction. Il a une longueur de 76 à 90 paires de bases et est composé d'une région anticodon, complémentaire d'un codon particulier de l'ARNm. L'ARN ribosomal (ARNr) est un composant des ribosomes. Certains des ARNr humains mesurent 5 kb.

Plus de 90% de l'ARN total est composé d'ARNt et d'ARNr. Seulement 1 à 5% de l'ARN total est constitué d'ARNm. Une cellule de mammifère typique peut être constituée d'environ 500 000 molécules d'ARNm par cellule. La quantité d'un type particulier d'ARNm peut être de 15 à 20 000 copies par cellule.

Comment isoler l'ARNm de l'ARN total

Un certain nombre de techniques de biologie moléculaire telles que la construction de banques d'ADNc, la préparation d'échantillons pour la préparation de puces à ADN, l'analyse par transfert de Northern pour des gènes faiblement exprimés, etc. nécessitent un ARNm de haute qualité. Il existe deux méthodes principales pour isoler l'ARNm de l'ARN total en fonction du type de cellules: méthode directe d'isolement de l'ARNm et méthode moins d'isolement de l'ARNm.

Méthode directe d'isolement d'ARNm

Le principe de la séparation de l'ARNm mature de l'ARN total eucaryote implique la chromatographie d'affinité / sélection d'affinité d'ARNm polyadénylé avec l'utilisation d'oligo dT (oligodésoxthymidylate) complémentaire de la queue poly (A). Il est rendu possible par l’absence de queue poly (A) dans les deux autres types d’ARN: ARNt et ARNr.. 

L'ARNm est constitué de 30 à 200 nucléotides d'adénine dans sa queue poly (A). Des colonnes d'affinité remplies d'une combinaison d'oligo dT / vecteur sont utilisées pour l'isolation d'ARNm à partir d'ARN total. La combinaison oligo dT / porteur peut être soit un oligo dT lié à la cellulose, soit un oligo dT biotinylé avec des billes magnétiques couplées à la streptavidine, soit des billes de polystyrène-latex couplées à un oligo dT. Toutes les conditions expérimentales doivent être dans des conditions exemptes de RNase pour éviter la dégradation enzymatique de l'ARN..

Figure 2: Chromatographie d'affinité

L'ARN total doit être dissous dans un tampon fortement salin et chauffé brièvement à 65-70 ° C pour perturber les structures secondaires de l'ARN. Les conditions pour l'isolement de l'ARN varient parmi les kits disponibles dans le commerce pour l'isolement de l'ARNm. Cependant, la préparation de poly (A) -ARN ou ARNm est composée de trois étapes.

1. Hybridation d'ARN poly (A) en molécules d'oligo dT connectées à un support
2. Lavage de l'ARN non lié
3. Elution d'ARN poly (A) à partir d'une combinaison oligo-dT / vecteur dans des conditions de faible stringence

Méthode Minus d'isolement d'ARNm

La purification de l'ARNm basée sur Oligo dT ne donne que de l'ARNm avec une queue poly (A) ou un ARNm eucaryote mature. Par conséquent, une autre méthode connue sous le nom de méthode moins peut être utilisée dans la purification d'ARNm qui n'ont pas de queue poly (A). Cette méthode peut être utilisée pour l'isolation d'ARNm à partir d'ARN total de levure et bactérien. Il peut également être utilisé dans l'isolement d'un type d'ARNm immature avec l'ARNm mature de cellules eucaryotes. Il implique l'enrichissement du transcriptome en réduisant les ARN ribosomaux volumineux de l'ARN total. Le RiboMinus^TM Le kit d'isolation du transcriptome de ThermoFisher Scientific utilise trois étapes pour la purification efficace de l'ARNm de l'ARN total de levure et bactérien.

1. Hybridation de l'ARN total avec des sondes oligonucléotidiques marquées en 5 'de biotine et spécifiques à la séquence de l'ARNr
2. Élimination du complexe de sonde marqué à l'ARNr / 5'-biotine avec les billes magnétiques revêtues de streptavidine
3. Purification des impuretés et élution de l'ARNm.

Conclusion

L'ARN total est composé des trois principaux types d'ARN: ARNm, ARNr et ARNt. La purification de l'ARN total à partir de l'ARN est essentielle pour l'analyse du transcriptome d'un organisme particulier. Les méthodes de purification sont basées sur le type d’ARNm. L'ARNm eucaryote, qui contient une queue poly (A), peut être isolé par chromatographie d'affinité avec de l'oligo dT. Les ARNm et les ARNm eucaryotes immatures de cellules de levure et bactériennes peuvent être isolés en éliminant le gros ARNr de l'ARN total..

Référence:

1. «Extraction d'ARNm». Thermo Fisher Scientific, disponible ici.
2. «Extraction d’ARN par type d’ARN». Thermo Fisher Scientific, disponible ici..

Courtoisie d'image:

1. «ARNm mature» (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. “Affinity” de Jamit sur Wikibooks anglais - Transféré de en.wikibooks à Commons par Adrignola en utilisant CommonsHelper (domaine public) via Commons Wikimedia