Comment faire des amorces pour PCR

Les amorces sont un composant essentiel dans l’amplification de l’ADN à la fois in vivo et in vitro. In vivo, l'enzyme, l'ADN polymérase nécessite un amorce pour l'initiation de la réplication de l'ADN. In vitro, les amorces sont principalement utilisées pour l'initiation de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR). Certaines autres techniques, notamment le séquençage, le clonage, la mutagenèse dirigée sur un site, etc., nécessitent des amorces. Par conséquent, la conception d’amorces pour in vitro Les techniques deviennent assez simples mais constituent un processus difficile pour les biologistes moléculaires. Par conséquent, cet article décrit les règles de base pour la conception de l’amorce pour la PCR et le séquençage..

Zones clés couvertes

1. Qu'est-ce qu'un apprêt
     - Définition, types, rôle
2. Comment fonctionnent les amorces dans un PCR
     - Caractéristiques de l'ADN, Processus de PCR
3. Comment faire des amorces pour PCR
     - Règles de base pour concevoir des amorces de PCR
4. Comment concevoir un amorce de séquençage
    - Caractéristiques des amorces de séquençage

Termes clés: Synthèse de l’ADN, amorces directes, longueur, température de fusion, PCR, amorces inverses, amorces de séquençage

Qu'est-ce qu'un apprêt

Une amorce est un brin court d'ADN ou d'ARN servant de point de départ à la synthèse de l'ADN. Les enzymes qui catalysent la réplication de l'ADN sont capables d'ajouter des nucléotides à une extrémité 3 'existante. Par conséquent, l’amorce jette les bases de la synthèse de l’ADN en servant de premier plan. Amorces d'ARN sont utilisés à l'intérieur de la cellule pour l'initiation de la réplication de l'ADN par l'ADN polymérase. Cependant, synthétique Amorces d'ADN peut être utilisé pour l'amplification de l'ADN, principalement par PCR et d'autres techniques. Deux types d'amorces sont utilisées dans la PCR et sont appelées amorces directes et inverses. Pendant la PCR, des millions de copies du fragment d'ADN souhaité peuvent être produites en encadrant cette séquence d'ADN particulière dans l'ADN génomique par des amorces directes et inverses. Les amorces directe et inverse qui encadrent une séquence d’ADN particulière sont indiquées dans Figure 1.

Figure 1: Amorces directe et inverse

Comment fonctionnent les amorces dans la PCR

L'ADN est une molécule ayant deux brins qui sont maintenus ensemble. Le motif de paire de bases est complémentaire à chacun dans les deux brins. Les deux brins sont maintenus ensemble par les liaisons hydrogène entre bases azotées complémentaires. De plus, chaque brin a sa propre direction. Un brin a une directionnalité de 5 'à 3' tandis que l'autre a une directionnalité de 3 'à 5'. Par conséquent, les deux volets sont antiparalliens. Le brin avec une direction de 5 'à 3' est connu sous le nom de brin sens, tandis que le brin avec une direction de 3 'à 5' est appelé brin antisens. Chaque deux brins doivent être synthétisés individuellement lors de la PCR.

Les trois étapes de la PCR sont la dénaturation, l’annelage et l’élongation. En dénaturation, les deux brins d'ADN sont séparés en rompant les liaisons hydrogène en les chauffant à 95 ° C. L'amorce directe se lie au brin sens tandis que l'amorce inverse se lie au brin antisens. Le recuit des apprêts survient lorsque la température baisse de 95 ° C à 50-60 ° C. Par conséquent, les deux volets peuvent être synthétisés en même temps à l’aide de Taq polymérase. L'amplification des brins sens et antisens se produit dans la direction 5 'à 3'. La PCR étant une réaction exponentielle, les trois étapes sont répétées tous les 25 à 35 cycles. Les amorces directe et inverse sont utilisées dans chaque cycle pour produire environ 2³⁵ des copies du fragment d'ADN désiré. Le rôle des amorces dans la PCR est montré dans Figure 2.

Figure 2: PCR

Comment faire des amorces pour PCR

Afin d'amplifier un fragment d'ADN particulier dans le génome, ce fragment d'ADN particulier devrait être flanqué à la fois par les amorces directe et inverse. Par conséquent, les deux amorces doivent être complémentaires des séquences qui encadrent le fragment d'ADN. Les directives de base pour la conception réussie des amorces de PCR sont décrites ci-dessous..

1. La direction des amorces avant et inverse doit être comprise entre 5 'et 3'.
2. La longueur de chaque amorce doit être comprise entre 18 et 25 nucléotides..
3. La teneur en GC des amorces est comprise entre 40 et 60% et la présence d'un C ou d'un G dans l'extrémité 3 'de l'amorce peut favoriser la liaison..
4. La température de fusion et la température Tm (la température à laquelle la moitié de l'apprêt a été recuite par rapport au modèle) de la paire d'amorces doivent être similaires et supérieures à 60 ° C. La différence maximale devrait être de 5 ° C.
5. L'extrémité 3 'de l'amorce doit correspondre exactement à l'ADN de la matrice.
6. Au moins les bases 2G ou C (pince GC) doivent être présentes dans les 5 dernières bases à l'extrémité 3 'de l'amorce. La pince GC favorise une forte liaison à la séquence cible.
7. Des sites de restriction de 5 à 6 nucléotides peuvent être ajoutés à l'extrémité 5 'de l'amorce.
8. Les répétitions dinucléotidiques (ATATATAT) ou les répétitions du même nucléotide plus de 4 fois (ACCCC) doivent être évitées dans les séquences d’amorces. Cela provoque une mauvaise amorce.
9. L'homologie intra-amorce ou les structures secondaires des amorces doivent être évitées. L'homologie inter-amorces ou les séquences complémentaires dans les amorces directe et inverse doivent être évitées. Les deux conditions peuvent former des auto-dimères ou des amorces-dimères.
10. La valeur ΔG pour l'analyse des dimères doit être comprise entre 0 et -9 kcal / mole.

De nombreux outils en ligne sont disponibles pour simplifier la conception des amorces tels que Primer 3, Primer X, NetPrimer, DNAstrar, etc. La spécificité des amorces conçues peut être déterminée par des outils tels que NCBI Primer-BLAST ou UCSC in-silico PCR. 

Figure 3: Interface de l'amorce 3

Comment concevoir un amorce de séquençage

Les amorces de séquençage sont courtes, les brins d'ADN, tout comme les amorces de PCR. Cependant, les amorces PCR sont conçues pour l'amplification d'un fragment d'ADN particulier, tandis que les amorces de séquençage sont utilisées pour révéler la séquence nucléotidique du fragment d'ADN amplifié par PCR. Contrairement aux amorces PCR, une seule amorce peut être utilisée dans le séquençage si seule la séquence cible a une longueur inférieure à 500 pb. Par exemple, l’amorce directe de la PCR peut être utilisée dans le séquençage, pour n’amplifier que le brin sens. De plus, le degré d'inadéquation toléré lors de la réaction de séquençage est supérieur à celui de la PCR. Généralement, les amorces de PCR sont complémentaires à la séquence cible. Cependant, certaines amorces de séquençage ne sont pas liées à la séquence cible. Ils sont connus comme des amorces universelles. Des amorces universelles telles que T7 ou SP6 sont associées au vecteur portant la séquence cible. Ils peuvent être utilisés pour une variété de vecteurs et divers types de fragments d'ADN.

Conclusion

Les amorces sont utilisées en PCR et en séquençage pour l'initiation de la synthèse de l'ADN. Deux types d'amorces de PCR peuvent être identifiés comme amorce directe et inverse. Les amorces directes s'annèlent au brin sens tandis que les amorces inverses s'annellent au brin antisens. Lors du séquençage, une amorce directe ou inverse peut être utilisée pour amplifier la cible. Lors de la conception des amorces, de nombreux facteurs doivent être pris en compte, tels que la longueur de l'amorce, la Tm et la teneur en GC. De nombreux outils en ligne sont disponibles et peuvent être utilisés pour la conception d’amorces pour une séquence particulière..

Référence:

1. «Primer Design: Astuces pour un processus efficace». Genome Compiler Corporation, 3 nov. 2015, disponible ici.
2. «Amorces de séquençage et conception d’amorces.» Amorces de séquençage et conception d’amorces, Université de Calgary, disponible ici..

Courtoisie d'image:

1. “Primers RevComp” de Zephyris - Propre travail (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. “Réaction en chaîne de la polymérase” de Enzoklop - Travail personnel (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia