Comment fonctionne le séquençage d'Illumina

Le séquençage Illumina est une méthode de séquençage de nouvelle génération, également appelée «séquençage par synthèse" méthode. Le séquençage d'Illumina est impliqué dans le traitement en parallèle de millions de fragments. Les quatre étapes de base impliquées dans le flux de travail de séquençage Illumina sont la préparation de la bibliothèque, la génération de grappes, le séquençage et l'analyse des données, qui sont décrits plus en détail dans cet article..

Zones clés couvertes

1. Qu'est-ce que le séquençage Illumina?
     - Définition, faits, avantages
2. Comment fonctionne le séquençage d'Illumina
     - Processus de séquençage d'Illumina:
          - Préparation de la bibliothèque
          - Génération de cluster
          - Séquençage
          - L'analyse des données

Termes clés: génération de grappes, analyse de données, séquençage Illumina, préparation de bibliothèques, séquençage par synthèse

Qu'est-ce que le séquençage Illumina?

La technologie de séquençage ou de séquençage par synthèse (SBS) d'Illumina est la technologie de séquençage de nouvelle génération la plus largement utilisée dans le monde. Plus de 90% des données de séquençage du monde sont générées par le séquençage Illumina. Il a été développé à l'origine par Shankar Balasubramanian et David Klenerman de l'Université de Cambridge. Ils ont fondé une société connue sous le nom de Solexa en 1998. Puis Illumina a acheté Solexa en 2007, améliorant rapidement la technologie d'origine. Par conséquent, la méthode s'appelle également Méthode de séquençage Solexa / Illumina. Le principal avantage du séquençage Illumina est qu’il offre un rendement élevé en lectures sans erreur..

Comment fonctionne le séquençage d'Illumina

Les quatre étapes du séquençage d'Illumina sont décrites ci-dessous..

Étape 1. Préparation de la bibliothèque

• Une bibliothèque de séquençage est préparée simultanément tagmentation de l'ADN en segments courts de 200 à 600 paires de bases par des transposases dans un processus appelé tagmentation, suivi de la ligature de l'adaptateur dans les extrémités 3 'et 5' des segments courts de l'ADN.
• Des motifs supplémentaires, tels qu'un site de liaison d'amorce de séquençage, un index et une région complémentaire de l'oligo de la cellule de flux, sont ajoutés à l'adaptateur des deux côtés par amplification de cycle réduite. La tagmentation et l’ajout de motifs sont indiqués dans Figure 1.

Figure 1: Tagmentation et ajout de motifs

Étape 2. Génération de cluster

• La bibliothèque de séquençage préparée est dénaturée et chargée dans un cellule d'écoulement pour la génération de cluster. Lors de la génération de la grappe, chaque fragment de la bibliothèque de séquençage est amplifié de manière isothermique. La Flow Cell est composée de pistes en verre. Chaque piste est recouverte de deux types d'oligonucléotides. Un type est complémentaire à la région 5 'des motifs supplémentaires et l'autre type est complémentaire à la région 3' des motifs supplémentaires de la bibliothèque préparée. Par conséquent, ces oligos se lient aux régions correspondantes de l'ADN dans la bibliothèque de séquençage. La Flow Cell avec deux types d’oligos est représentée dans Figure 2. L'oligo qui se lie à la région 5 'de la bibliothèque de séquençage est de couleur rose, tandis que l'oligo qui se lie à la région 3' de la bibliothèque de séquençage est de couleur verte..

Figure 2: Cellule à circulation

• Une fois que la bibliothèque de séquençage simple brin est liée à l'oligo, le brin complémentaire est généré par l'ADN polymérase. Ensuite, l'ADN double brin résultant est dénaturé et le brin d'origine est éliminé par lavage..
• le amplification clonale du fragment est réalisé par amplification en pont. Au cours de ce processus, le brin se plie sur le deuxième type d'oligo sur la Flow Cell. Ensuite, la polymérase synthétise le pont double brin. La dénaturation du pont entraîne la formation de deux brins d’ADN: les brins direct et inverse sur les oligos de la Flow Cell..
• L'amplification en pont est répétée à plusieurs reprises pour obtenir simultanément des millions de groupes de tous types de fragments dans la bibliothèque de séquençage par amplification clonale. L’amplification clonale est montrée dans figure 3.

Figure 3: Amplification clonale

• Ensuite, les brins inversés sont lavés, ne retenant que les brins avant de la Flow Cell. Dans le brin avant, l'extrémité 3 'est libre et elle est bloquée afin d'empêcher l'amorçage non désiré.

Étape 3. Séquençage

Première lecture de la séquence inverse

• Le séquençage commence par le extension du premier amorce de séquençage. Le procédé de séquençage Illumina utilise des dNTP modifiés, qui contiennent un terminateur en position 3 'du sucre désoxyribose. Ces dNTP sont également marqués par fluorescence dans différentes couleurs.

• Après l’ajout de chaque nucléotide complémentaire, on observe les amas dans la cellule à flux continu pour l’émission de fluorescence..

• Après détection de la lumière, le fluorophore peut être lavé.

• Ensuite, le groupe de terminaison de la position 3 'du sucre est régénéré par un groupe hydroxyle, permettant l'ajout d'un deuxième dNTP à la chaîne en croissance. Ce processus s'appelle séquençage par synthèse. Le séquençage par synthèse est présenté dans figure 4.

Figure 4: Séquençage par synthèse

• A la fin de la synthèse, le première lecture de la séquence inverse est obtenu et le produit de séquençage est lavé.

Index 1 lu

• L'amorce de l'index 1 est ensuite hybridée en grappes pour générer une deuxième lecture de la même manière par séquençage par synthèse. Le produit de séquençage est lavé.

Index 2 lu

• L’extrémité 3 'de la grappe est alors déprotégée, ce qui permet l’hybridation de l’extrémité 3' avec le deuxième type d’oligo sur la Flow Cell (couleur verte). Par ceci, la séquence de la région d'index 2 est obtenue. Le produit de séquençage est lavé.

Deuxième lecture de la séquence en avant

• Le second type d'oligo est prolongé par une polymérase, formant un pont double brin. Le pont est dénaturé et leurs extrémités 3 'sont bloquées. Le brin avant est emporté.
• le deuxième lecture de la séquence en avant est obtenu par séquençage par synthèse par hybridation et extension de la seconde amorce de séquençage.

Étape 4. Analyse des données

• Les milliards de lectures obtenues par séquençage sont regroupées en fonction de leurs séquences d'index..
• Ensuite, les séquences avec des lectures similaires sont regroupées.
• Les lectures avant et arrière sont appariées pour former des séquences contiguës.
• Les alignements ambigus peuvent être résolus par des séquences appariées.
• Les séquences contiguës sont alignées sur le génome de référence pour l'identification de variants.

La vidéo suivante explique le processus complet du séquençage d'Illumina.

Conclusion

Le séquençage d'Illumina est une méthode de séquençage de nouvelle génération. Le séquençage d'Illumina est impliqué dans la préparation d'une bibliothèque de séquençage avec des fragments d'ADN longs de 200 à 600 paires de bases. Les quatre étapes du séquençage d'Illumina sont la préparation de la bibliothèque, la génération de grappes, le séquençage et l'analyse des données. Comme le séquençage Illumina donne des lectures de séquences avec une grande précision, il s'agit de la méthode de séquençage largement utilisée dans le monde..

Référence:

1. «Technologie de séquençage par synthèse (SBS)». Technologie de séquençage | Séquençage par synthèse, Disponible ici.

Courtoisie d'image:

1. «Préparation du traitement de l’ADN» Par DMLapato - Travail personnel (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia
2. “Chaînes oligonucléotidiques dans une cellule de flux” Par DMLapato - Travail personnel, (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia
3. «Séquencement par synthèse des terminateurs réversibles» de Abizar Lakdawalla (discussion) - J'ai créé cet ouvrage entièrement par moi-même (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
4. “Génération de grappes” par DMLapato - Propre travail (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia