Différence entre le séquençage de Sanger et le pyroséquençage

Différence clé - Séquençage de Sanger vs pyroséquençage
 

Le séquençage de l'ADN est très important pour l'analyse de l'ADN car la connaissance de la disposition correcte des nucléotides sur une région particulière de l'ADN révèle de nombreuses informations importantes à ce sujet. Il existe différentes méthodes de séquençage de l'ADN. Le séquençage de Sanger et le pyroséquençage sont deux méthodes différentes de séquençage de l'ADN largement utilisées en biologie moléculaire. La principale différence entre le séquençage de Sanger et le pyroséquençage est que Le séquençage Sanger utilise des didésoxynucléotides pour mettre fin à la synthèse de l'ADN afin de lire la séquence nucléotidique, tandis que le pyroséquençage détecte la libération de pyrophosphate en incorporant les nucléotides et en synthétisant la séquence complémentaire pour lire l'ordre exact de la séquence..

CONTENU
1. Vue d'ensemble et différence clé
2. Qu'est-ce que le séquençage Sanger?
3. Qu'est-ce que le pyroséquençage?
4. Comparaison côte à côte - Séquençage Sanger vs pyroséquençage
5. Résumé

Qu'est-ce que le séquençage Sanger??

Le séquençage Sanger est une méthode de séquençage d’ADN de première génération mise au point par Frederick Sanger et ses collèges en 1977. Elle est également connue sous le nom de Séquence de terminaison de chaîne ou Séquençage didésoxy car il est basé sur la terminaison de chaîne par les didésoxynucléotides (ddNTP). Cette méthode a été largement utilisée pendant plus de 30 ans jusqu'à ce que le séquençage de nouvelle génération (NGS) soit développé. La technique de séquençage de Sanger a permis la découverte de l'ordre correct des nucléotides ou la fixation d'un fragment d'ADN particulier. Il repose sur l’incorporation sélective de ddNTP et la terminaison de la synthèse de l’ADN au cours de la in vitro Réplication de l'ADN. L'absence de groupes OH en 3 'pour poursuivre la formation de liaisons phosphodiester entre les nucléotides adjacents est une caractéristique unique des ddNTP. Par conséquent, une fois que le ddNTP est attaché, l’élongation de la chaîne cesse et se termine à partir de ce point. Il y a quatre ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP et ddTTP - utilisés dans le séquençage de Sanger. Ces nucléotides arrêtent le processus de réplication de l'ADN lorsqu'ils sont incorporés au brin en croissance de l'ADN et donnent lieu à des longueurs variables d'ADN court. L'électrophorèse sur gel capillaire est utilisée pour organiser ces brins d'ADN courts selon leur taille sur un gel, comme illustré à la figure 01..

Figure 1: Électrophorèse sur gel capillaire de l'ADN court synthétisé

Pour in vitro réplication de l'ADN, peu d'exigences doivent être fournies. Ce sont l'enzyme ADN polymérase, l'ADN matrice, les amorces oligonucléotidiques et les désoxynucléotides (dNTP). Dans le séquençage de Sanger, la réplication de l'ADN est effectuée dans quatre tubes à essai séparés avec quatre types de ddNTP séparément. Les désoxynucléotides ne sont pas totalement remplacés par les ddNTP respectifs. Un mélange du dNTP particulier (par exemple, dATP + ddATP) est inclus dans le tube et répliqué. Quatre produits de tube séparés sont traités sur un gel dans quatre puits séparés. Ensuite, en lisant le gel, la séquence peut être construite comme indiqué à la figure 02..

Figure 02: Séquence de Sanger

Le séquençage de Sanger est une technique importante qui aide dans de nombreux domaines de la biologie moléculaire. Le projet sur le génome humain a été mené à bien avec l’aide des méthodes de séquençage de Sanger. Le séquençage de Sanger est également utile dans les domaines suivants: séquençage d'ADN, recherche sur le cancer et les maladies génétiques, analyse de l'expression génique, identification humaine, détection d'agents pathogènes, séquençage microbien, etc..

Le séquençage de Sanger présente plusieurs inconvénients:

• La longueur de l'ADN en cours de séquence ne peut pas dépasser 1000 paires de bases
• Un seul brin peut être séquencé à la fois.
• Le processus prend du temps et coûte cher.

Par conséquent, de nouvelles techniques de séquençage avancées ont été développées avec le temps pour surmonter ces problèmes. Cependant, le séquençage de Sanger est toujours utilisé en raison de ses résultats extrêmement précis, jusqu'à environ 850 fragments de longueur de base..

Qu'est-ce que le pyroséquençage??

Le pyroséquençage est une nouvelle technique de séquençage de l'ADN basée sur le «séquençage par synthèse». Cette technique repose sur la détection de la libération de pyrophosphate lors de l'incorporation de nucléotide. Le procédé utilise quatre enzymes différentes: l’ADN polymérisé, l’ATP sulfurylase, la luciférase et l’apyrase, ainsi que deux substrats, l’adénosine 5 'phosphosulfate (APS) et la luciférine..

Le processus commence par la liaison de l'amorce avec la matrice d'ADN simple brin et l'ADN polymérase commence l'incorporation de nucléotides qui lui sont complémentaires. Lorsque les nucléotides se rejoignent (polymérisation d'acide nucléique), il libère des groupes pyrophosphate (deux groupes phosphate liés ensemble) et de l'énergie. Chaque addition de nucléotide libère une quantité équimolaire de pyrophosphate. Le pyrophosphate se transforme en ATP par l’ATP sulfurylase en présence de substrat APS. L'ATP généré pilote la conversion de la luciférine en oxyluciférine induite par la luciférase, produisant de la lumière visible en quantités proportionnelles à la quantité d'ATP. La lumière est détectée par un dispositif de détection de photons ou par un photomultiplicateur et crée un pyrogramme. L'apyrase dégrade l'ATP et les dNTP non incorporés dans le mélange réactionnel. L'ajout de dNTP est effectué une fois à la fois. L'addition de nucléotide étant connue en fonction de l'incorporation et de la détection de la lumière, la séquence de la matrice peut être déterminée. Le pyrogramme est utilisé pour générer la séquence nucléotidique de l’ADN de l’échantillon, comme illustré à la figure 03..

Le pyroséquençage est très important dans l'analyse du polymorphisme d'un nucléotide simple et dans le séquençage de courts segments d'ADN. La haute précision, la flexibilité, la facilité d’automatisation et le traitement en parallèle sont les avantages du pyroséquençage par rapport aux techniques de séquençage Sanger.

Figure 03: Pyroséquençage

Quelle est la différence entre le séquençage de Sanger et le pyroséquençage?

Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Le séquençage Sanger est une méthode de séquençage de l'ADN basée sur l'incorporation sélective de ddNTP par l'ADN polymérase et la terminaison de chaîne..	Le pyroséquençage est une méthode de séquençage de l’ADN basée sur la détection de la libération de pyrophosphate lors de l’incorporation de nucléotide.
Utilisation de ddNTP
Les ddNTP sont utilisés pour mettre fin à la réplication de l'ADN	Les ddNTP ne sont pas utilisés.
Enzymes impliquées
ADN polymérase sont utilisés.	Quatre enzymes sont utilisées: ADN polymérase, ATP sulfurylase, Luciférase et Apyrase..
Substrats Utilisés
APS et luciférine ne sont pas utilisés.	L'adénosine 5 'phosphosulfate (APS) et la luciférine sont utilisés.
Température maximale
C'est un processus lent.	C'est un processus rapide.

Résumé - Séquençage Sanger vs pyroséquençage

Le séquençage Sanger et le pyroséquençage sont deux méthodes de séquençage de l'ADN utilisées en biologie moléculaire. Le séquençage de Sanger construit l'ordre des nucléotides en séquence en mettant fin à l'allongement de la chaîne tandis que le pyroséquen construit l'ordre précis des nucléotides en séquence en incorporant des nucléotides et en détectant la libération de pyrophosphates. Par conséquent, la principale différence entre le séquençage de Sanger et le pyroséquençage réside dans le fait que le séquençage de Sanger fonctionne sur le séquençage par terminaison de chaîne tandis que le pyroséquen fonctionne sur le séquençage par synthèse..

Référence:
1. Fakruddin, Md et Abhijit Chowdhury. «Le pyroséquençage: une alternative au séquençage Sanger traditionnel.» American Journal of Biochemistry and Biotechnology. Science Publications, 02 mars 2012. Web. 28 février 2017.
2. «Séquençage Sanger». Séquençage Sanger - Rubriques ScienceDirect. N.p., n.d. Web. 28 février 2017

Courtoisie d'image:
1. “Didesoxy-Methode” de Christoph Goemans (modifié) - Dr. Norman Mauder, Directeur général de la Fondation Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) via Wikimedia Commons
2. “Sanger-DNA-seq” Par Enzo sur Wikipedia polonais (CC BY-SA 3.0) via Wikimedia Commons
3. «Pyroséquençage» par microbiologie (CC BY-SA 2.0) via Flickr