Comment fonctionne le séquençage de l'ADN
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Le séquençage est le processus impliqué dans la détermination d'une séquence de nucléotides d'un fragment d'ADN particulier. Pendant le séquençage, le fragment d'ADN est marqué de manière terminale avec des nucléotides marqués par fluorescence par PCR. Ce processus utilise quatre types de nucléotides marqués par fluorescence et ce sont des didésoxynucléotides (ddNTP). Les ddNTP n'ont pas de groupe OH en 3 'auquel le groupe phosphate du nucléotide entrant est attaché. Par conséquent, lorsqu'un ddNTP est ajouté à la chaîne en croissance, il n'y aura plus d'addition de nucléotides à l'extrémité 3 'de la chaîne. Cela signifie que l'ajout d'un ddNTP à la chaîne en croissance met fin à la croissance de la chaîne. Etant donné que les ddNTP sont ajoutés au mélange de PCR à de faibles concentrations, chaque chaîne en croissance se termine à des niveaux différents. La fluorescence émettrice est détectée pour déterminer la séquence de nucléotides du fragment d’ADN à la fin de la PCR..
Zones clés couvertes
1. Qu'est-ce que le séquençage de l'ADN?
- Définition, types
2. Comment fonctionne le séquençage de l'ADN
- Processus de séquençage de l'ADN
Mots-clés: didésoxynucléotides (ddNTP), marqueur fluorescent, électrophorèse sur gel, séquençage de nouvelle génération, séquence de nucléotides, PCR, séquençage de Sanger
Qu'est-ce que le séquençage de l'ADN?
Le séquençage de l'ADN est une technique de laboratoire utilisée dans la détermination de la séquence nucléotidique d'une molécule d'ADN particulière. Il utilise des nucléotides marqués par fluorescence, qui sont incorporés au cours de la PCR. Il existe deux méthodes principales de séquençage basées sur les techniques utilisées pour la détection de la fluorescence: le séquençage Sanger et le séquençage de nouvelle génération..
Sanger Séquençage
Le séquençage Sanger, développé par Fredric Sanger en 1975, est la première méthode de séquençage développée. Il est également connu comme méthode de terminaison de chaîne puisque il participe à l’incorporation sélective de ddNTPs se terminant en chaîne au cours de in vitro Synthèse de l'ADN. Dans le séquençage de Sanger, les amplicons sont séparés par électrophorèse sur gel. Le séquençage de Sanger est largement utilisé pour la détermination de la séquence des fragments d'ADN utilisés dans le clonage et des fragments amplifiés par PCR. Une séquence d’ADN déterminée est montrée dans Figure 1.
Figure 1: Séquençage de l'ADN
Séquençage de nouvelle génération
Les technologies de séquençage de l'ADN les plus récentes sont collectivement appelées séquençage de nouvelle génération. C'est aussi une méthode de terminaison de chaîne. Le séquençage de nouvelle génération utilise l'électrophorèse capillaire pour la séparation d'amplicons de différentes longueurs créées par la méthode de terminaison de chaîne. Le séquençage de nouvelle génération est utilisé dans la détermination d’un grand nombre de nucléotides par cycle, comme dans le séquençage du génome..
Comment fonctionne le séquençage de l'ADN
Pendant le séquençage de l'ADN, des nucléotides marqués par fluorescence sont ajoutés à un fragment d'ADN particulier par PCR. Pour l'élongation du brin d'ADN, des désoxynucléotides réguliers (dNTP) sont utilisés. Cependant, les ddNTP sont ajoutés au mélange réactionnel, qui est marqué par fluorescence. Puisque les ddNTP n'ont pas de groupe OH en 3 'dans la molécule de sucre de désoxyribose, il est possible que la croissance de la chaîne ne se produise pas, ce qui met fin à la croissance de la chaîne. Le squelette sucre-phosphate de l'ADN est formé par la formation de liaisons phosphodiester entre le groupe OH en 3 'du sucre de désoxyribose et le groupe phosphate du nucléotide entrant. Cependant, les ddNTP sont ajoutés en faibles concentrations; par conséquent, ils ne terminent pas immédiatement la croissance de la chaîne.
Quatre types de ddNTP sont ajoutés à quatre mélanges de PCR distincts. Quatre réactions de PCR distinctes sont effectuées en ajoutant ddATP, ddGTP, ddCTP et ddTTP. Par conséquent, dans chaque mélange réactionnel, la croissance de la chaîne se termine aux nucléotides A, G, C et T, respectivement. A titre d'exemple, dans le mélange réactionnel additionné de ddATP, la croissance de différents amplicons est interrompue à chaque nucléotide A du fragment d'ADN. La détermination de la séquence d’ADN par séquençage de Sanger est présentée dans Figure 2.
Figure 2: Séquençage Sanger
Chacun des quatre types de nucléotides est marqué par une couleur de fluorescence distincte; la ddATP est marqué avec un colorant vert; la Le ddGTP est marqué avec un colorant jaune; la ddCTP est marqué en bleu; la ddTTP est marqué avec un colorant rouge. Par conséquent, les amplicons des quatre réactions de PCR sont marqués dans des couleurs séparées..
Après l’amplification du fragment d’ADN intéressé, les amplicons sont séparés par électrophorèse sur gel ou par électrophorèse capillaire. La séquence nucléotidique du fragment d'ADN peut être déterminée par la détection de la fluorescence émettrice. La séquence de nucléotides de 750-1 000 paires de bases de longs fragments peut être facilement déterminée par analyse par séquençage de Sanger. Cependant, la détermination de la séquence nucléotidique d'un génome entier reste difficile à traiter en raison du grand nombre de nucléotides contenus dans les génomes. Cependant, avec les techniques de séquençage de nouvelle génération telles que le séquençage 454, environ 20 millions de paires de bases peuvent être lues par analyse..
Conclusion
Le séquençage de l'ADN est une technique de biologie moléculaire utilisée dans la détermination de la séquence nucléotidique de fragments d'ADN. Pendant le séquençage, des nucléotides marqués par fluorescence sont ajoutés aux fragments d'ADN par PCR. En détectant la fluorescence émettrice, la séquence de nucléotides peut être déterminée.
Référence:
1. "Séquençage de l'ADN." Académie Khan, Disponible ici.
Courtoisie d'image:
1. “Séquence ADN” Par Sjef - Travail personnel, domaine public) via Commons Wikimedia
2. “Didesoxy-Methode” de Christoph Goemans (modifié) - Dr. Norman Mauder, Directeur général de Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
